使用說明：
1.PCR反應體系的設置：
a.溶解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將BeyoAmp? Extra-long DNA polymerase置于冰浴上或冰盒內。
b.參考下表在冰浴上設置PCR反應(如果有多個類似的PCR反應，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoAmp? Extra-long DNA polymerase的混合物，然后分裝到各PCR反應管內。根據情況，有時混合物中可以包括引物)：

*對于不同類型模板DNA的推薦用量如下：哺乳動物基因組DNA 100ng-500ng；大腸桿菌基因組DNA 100pg-100ng；質粒DNA 1ng-20ng。擴增大于25kb的片段時，模板量宜適當加大，但過多的模板DNA也容易導致非特異性的PCR產物。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果用的PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))以防止蒸發(fā)。
e.各設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。
2.PCR反應參數的設置可以參考如下表格：

說明：上面表格中15sec/kb表示，如果擴增片段是4kb，那么68℃的延伸時間為1分鐘。0.5min/kb表示如果擴增片段是4kb，那么68℃的延伸時間為2分鐘。*對于大于25kb的長片段PCR，建議采用兩步法，將退火/延伸溫度合并為68℃，可顯著提高擴增特異性。
a.最初變性和變性的溫度設置為94℃，延伸溫度設置為72℃，其余條件不變時，都可以進行正常的PCR擴增，但擴增效果會稍有下降。對于較難擴增的序列，推薦使用92℃變性和72℃延長。
b.PCR反應的設置需根據模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的變性、退火和延伸的溫度和時間以及循環(huán)數等。
c.對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預期的PCR產物，可以把循環(huán)數設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應，循環(huán)數需要進行適當優(yōu)化，使PCR反應沒有達到平臺期。

常見問題：
1.PCR產物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當的引物設計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應地根據GC-rich buffer的要求或說明調整PCR反應參數的設置。直接添加1-10%DMSO或5-20%甘油對于擴增高GC含量的片段也有幫助。
c.PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
d.由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索最佳的退火溫度。
f.延伸時間不足?？梢栽谕扑]的延伸時間基礎上把延伸時間延長2-5倍，對于較難擴增的片斷可以設置為每1kb延伸1分鐘。
g.待擴增片斷GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調節(jié)起始變性條件至94℃ 2-4min甚至94℃ 5min。
h.在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
i.循環(huán)數不足，適當延長PCR的循環(huán)數。通常循環(huán)數最高不必超過40，常用的循環(huán)數范圍為25-35。
j.模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設計的PCR引物內側再設計一對PCR引物，然后對第一次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從第一次PCR產物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對第一次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
k.模板中含有抑制PCR反應的物質，可以用適當的DNA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
l.對PCR引物進行脫鹽純化。
m.使用高質量的dNTP混合物。
n.適當增加DNA polymerase的用量。
o.當產生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
p.注意設置適當的陽性對照和陰性對照通常會有很大幫助。
q.使用完整、高純度、高質量的DNA模板，且避免模板反復凍融。長片段DNA反復凍融過程中可能會出現(xiàn)斷裂的問題。
r.Mg²⁺濃度較低，或Mg²⁺與dNTP的比例不合適。使用本產品中提供的緩沖液就無需擔心鎂離子濃度的問題。
s.根據片段大小選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度和電泳條件。大片段DNA的電泳需要使用低濃度的瓊脂糖凝膠和較低的電泳電壓，并電泳較長的電泳時間。
t.PCR反應體系中有氣泡或者溶液蒸發(fā)。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高2-5℃。
b.減少DNA模板的用量。
c.PCR反應設置時在室溫進行容易產生非特異性條帶。推薦在冰浴上設置PCR反應。
d.適當減少BeyoAmp? Extra-long DNA Polymerase的用量。
e.適當縮短延伸時間。

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