碧云天的BeyoFast? Probe One-Step qRT-PCR Kit是一種基于TaqMan等探針的用于一步法反轉錄實時熒光定量PCR，即qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR)或real-time RT-PCR的高品質預混液，主要用于RNA的特異性超高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。
BeyoFast? Probe One-Step qRT-PCR Kit以提取的RNA為模版，使用qPCR引物在同一反應管內連續(xù)進行反轉錄和熒光定量PCR，操作簡單快速，最大限度地減少人為誤差，有效降低污染風險，節(jié)約PCR實驗的操作時間，檢測通量大。
本產品整合了高效的BeyoRT? M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和優(yōu)異的抗體結合型熱啟動BeyoFast? Taq DNA Polymerase，并優(yōu)化了緩沖體系，反轉錄性能優(yōu)、檢測靈敏度高、擴增特異性強、反應穩(wěn)定性好，非常適合于內源低豐度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的檢測。
檢測原理：探針法qPCR不使用熒光染料如SYBR Green等對PCR產物進行熒光染色，而是采用了熒光基團和淬滅基團(quencher)標記的DNA探針靶向擬通過PCR檢測的目標序列(設計的探針結合位點通常位于兩條引物結合位點之間)。正常情況下，探針上的淬滅基團由于空間上的熒光共振能力轉移(FRET)而導致熒光基團淬滅。在PCR反應擴增目標序列時，引物和探針都會退火到目標基因上，隨著引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性會導致結合在目標序列上的探針從5’端開始逐漸被降解。探針的熒光基團和淬滅基團被Taq酶切開后，淬滅基團的作用消失，熒光基團就能正常地被激發(fā)光所激發(fā)而產生熒光了。每經過一個PCR循環(huán)，就會有更多的熒光基團被釋放，熒光強度與新合成的目標片段數量成正比，從而就可以實現定量檢測了。探針通常是目標序列特異性的一段線性DNA，5'端標記FAM或HEX等熒光基團，3'端標記BHQ1、TAMRA或MGB等熒光淬滅基團。
本產品的特異性好、靈敏度高：特異性并不僅僅依賴于PCR引物，探針和目標基因發(fā)生特異性的結合和降解，才能生成熒光信號，檢測靈敏度和特異性通常要顯著高于使用SYBR Green等熒光染料的方法。
本產品可用于多重檢測：單個反應孔中，不同基因對應不同探針，不同探針對應不同熒光標記，即可進行多重熒光定量PCR檢測。經測試，在適當優(yōu)化引物和探針后，本產品可同時用于2-3個基因的檢測。
本產品使用的BeyoFast? Taq DNA Polymerase是一種與抗體結合的高品質熱啟動酶，能夠實現便捷高效的熱啟動。BeyoFast? Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應的預變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應，從而大大提高了PCR反應的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產品包含了BeyoRT? M-MuLV Reverse Transcriptase、BeyoFast? Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、穩(wěn)定劑、Nuclease-free Water、ROX (根據不同熒光定量PCR儀進行選擇)和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、探針和樣品RNA即可。
本產品提供了Low ROX和High ROX，廣泛兼容于無需ROX和需要Low ROX或High ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀。ROX的作用是用于校正與PCR無關的熒光波動，從而最大限度減少孔間差異。這種差異可能由多種因素引起，如移液誤差及樣品蒸發(fā)等。不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據實際所用儀器在配制反應體系時選擇高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不加ROXProbe。Probe常用儀器所需ROX類型請參考如下表格。
| 添加ROX類型 | 適用PCR儀 |
| 不需添加 |
Bio-Rad: CFX384, CFX96, MiniOpticon, iCycler IQ, MyiQ and iQ5; Eppendorf: Mastercycler ep realplex and realplex2 s; Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 6000; Roche LightCycler 480; Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR |
| Low ROX |
ABI: 7500(Fast), ViiA 7, QuantStudio 6 and 7 Flex Systems; Stratagene: Mx3000P, Mx3005P and Mx4000; Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 3000; Bio-Rad/MJ: Chromo4, Opticon 2 and Opticon; |
| High ROX | ABI GeneAmp 5700; ABI PRISM 7000, 7700; ABI 7300, 7900HT(Fast); ABI StepOne(Plus) |
如果用于常規(guī)的96孔板qRT-PCR檢測(建議反應體系為20μl)，本產品小包裝D7277S可以進行100次檢測，中包裝D7277M可進行500次檢測；如果用于常規(guī)的384孔板qRT-PCR檢測(建議反應體系為10μl)，本產品小包裝D7277S可以進行200次檢測，中包裝D7277M可進行1000次檢測。
包裝清單：
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| D7277S-1 | Probe One-Step Enzyme Mix (10X) | 200μl |
| D7277S-2 | Probe One-Step Reaction Buffer (2X) | 1ml |
| D7277S-3 | Nuclease-free Water | 1ml |
| D7277S-4 | Low ROX (50X) | 40μl |
| D7277S-5 | High ROX (50X) | 40μl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| D7277M-1 | Probe One-Step Enzyme Mix (10X) | 1ml |
| D7277M-2 | Probe One-Step Reaction Buffer (2X) | 5ml |
| D7277M-3 | Nuclease-free Water | 5ml |
| D7277M-4 | Low ROX (50X) | 200μl |
| D7277M-5 | High ROX (50X) | 200μl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃避光保存，兩年有效。盡量避免反復凍融。
注意事項：
探針的熒光標記須根據所使用的qPCR儀熒光兼容性來確定。對于需要ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀，避免使用ROX標記探針。
用于多重檢測時，需要適當優(yōu)化引物和探針，并使用適當的不同熒光基團標記探針，確定效果后再進行多重檢測，一般建議不超過三重檢測。
請注意避免RNase污染，使用RNase-free的槍頭、離心管等。
Probe One-Step Enzyme Mix (10X)含有高濃度甘油，粘度高，使用前將短暫離心至管底，并用移液器輕輕混勻，混勻過程中盡量避免產生氣泡，然后緩慢準確吸取。
使用前需確保Probe One-Step Reaction Buffer (2X)完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用。
如果擴增片段較長或者RNA結構較為復雜，可將模板RNA在65℃預處理5-10分鐘，可提高反轉錄效率。
本反應使用qPCR的Reverse Primer作為反轉錄的基因特異性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一鏈合成的引物。
注意引物退火溫度，當退火溫度<60℃時，推薦使用三步法PCR擴增。
對于超過350bp或者高GC含量的擴增片段，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。
經測試，本產品反復凍融10次對使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復凍融本產品，反復凍融可能使產品性能下降。
qPCR檢測是超高靈敏度的檢測，PCR反應設置區(qū)域需盡量避免各種可能的待擴增產物的污染。PCR產物宜密封后丟棄，以避免超高濃度的PCR產物污染實驗環(huán)境。
本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
黨沛 
